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    4. 学术交流

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      两种规格匹伐他汀钙片的微生物方法验证与结果分析
      发布时间:2014/8/11  浏览次数:4662 次  来源:陕西省食品药品监督检验研究院

      两种规格匹伐他汀钙片的微生物方法验证与结果分析

      张丹1,闵红1,郭耀武1,陈书伏1,卫延明2

      1.陕西省食品药品检验所,西安 710061;2.陕西省渭南市药品检验所,渭南 714000

        要:目的:建立匹伐他汀钙片微生物限度检查方法。方法:采用稀释液加入增溶剂和促微生物生长物质后常规法及培养基稀释法(0.2ml/皿和0.5ml/皿)进行方法验证。结果:确立了匹伐他汀钙片的微生物限度检查方法。细菌可采用常规法;真菌可经过稀释液(2)稀释后,采用培养基稀释法(0.2ml/皿);大肠埃希菌可采用常规法。结论:白色念珠菌和黑曲霉对匹伐他汀钙片非常敏感,可作为匹伐他汀钙片微生物限度检查方法的质控菌株。

      关键词:匹伐他汀钙片;微生物限度检查;方法验证

      ABSTACT  OBJECTIVE: To establish the methods of the microbial limit tests for Pitavastatin Calcium. METHODS: Solubilizer and growth promoting agents of microbe was added into dilution, and then used routine method, medium diluting method0.2ml/plate0.5ml/plate for the verification of methodology. RESULTS: Microbial limit tests for Pitavastatin Calcium were established. The bacteria could use routine method, fungi could use medium diluting method0.2ml/plateafter it was diluted by dilution(2). CONCLUSTIONS: Aspergillus brasiliensis and Candida albicans were sensitive to Pitavastatin Calcium,so it was considered to be quality control strains of Pitavastatin Calcium.

      KEY WORDS  Pitavastatin Calcium; microbial limit tests; verification of methodology

       

      匹伐他汀钙片为(+{3R,5S,6E—7—[2—环丙基—4—4—氟苯基)-3—喹啉基]—3,5—二羟基—6—庚酸}单钙盐,主要用于高胆固醇血症和家族性高胆固醇血症,其主要成分匹伐他汀(pitavastatin)20037月首次在日本上市的新一代3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂,具有高度的肝细胞选择性,主要是通过抑制内源性胆固醇的合成,使肝脏内低密度脂蛋白胆固醇(LDL—C)受体下调,从而加快LDL—C在血中的清除速度,发挥明显的降血脂和抗动脉粥样硬化作用。在进行微生物限度检查时发现其具有抑菌作用,笔者按照中国药典2010年版二部,建立了匹伐他汀钙片微生物限度检查法,为该类品种制定微生物限度标准提供了科学依据。

      1 仪器与材料

      1.1 仪器:LRH-250-1786X真菌培养箱(上海一恒);WGP-600.200.11382隔水式培养箱(重庆万达);WGP-600.200.11381隔水式培养箱(重庆万达)。

      1.2 供试品:匹伐他汀钙片(规格分别为1mg/片与2mg/片),西安正大制药有限公司,批号:20101001。

      1.3 稀释液:(1pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液;(2pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液-吐温80-胰酪胨大豆肉汤(90mL:10mL:3g)。

      1.4 培养基:营养琼脂培养基(批号 080922)、 玫瑰红钠琼脂培养基(批号 0810233)、营养肉汤培养基(批号 070518)、改良马丁液体培养基(批号 0810203)、胆盐乳糖培养基(批号 0805282 均由北京三药科技开发公司生产。

      1.5 菌种:枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis[CMCC(B)63501]、 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus[CMCC(B)26003]、大肠埃希菌(Escherichia coli[CMCC(B)44102]、白色念珠菌(Candida albicans[CMCC(F)98001]、 黑曲霉菌(Aspergillus niger[CMCC(F)98003]均由中国医学细菌保藏中心提供。

      2 方法与结果

      2.1 实验菌液制备:分别取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基,于3035℃培养1824小时,取1ml加入9ml0.9%)无菌氯化钠溶液中,10倍稀释制成50100cfu.ml-1的菌悬液。取白色念珠菌的的新鲜培养物至改良马丁培养基,经2328℃2448小时,取1mL加入9ml0.9%)无菌氯化钠溶液中,10倍稀释制成50100cfu.ml-1的菌悬液。接种黑曲霉菌至改良马丁琼脂斜面培养基,经2328℃培养7d,加入含0.05%ml/ml)聚山梨酯80的氯化钠溶液,将孢子洗脱,经过9ml0.05%mL/mL)聚山梨酯80的氯化钠溶液10倍稀释制成50100cfu.mL-1的菌悬液,备用。

      2.2 供试液(1)与供试液(2)的制备:称取供试品10g,分别加入到稀释液(1与稀释液2)至100mL,制备成1:10供试液。

      2.3 方法验证

      2.3.1 常规法:取供试液(1)或供试液(21mL,分别加入金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠埃希菌50100cfu,立即倾倒15-20ml营养琼脂培养基,待培养基凝固后于3537oC培养2472h,计数;或分别加入白色念珠菌和黑曲霉菌50100cfu,立即倾倒15-20ml玫瑰红钠琼脂培养基,待培养基凝固后于2328oC培养24-72h,计数,作为试验组(1)或试验组(2);同法测定所加的试验菌数作为菌液组;测定供试品的本底菌数作为供试品对照组。另外增加了稀释剂对照组,方法同试验组(将供试液换成了稀释剂),标准规定:试验组菌、 稀释剂对照组菌的回收率均应不低于70%。根据以下公式计算回收率,试验组菌的回收率(%=[(试验组菌数-供试品对照组菌数)/菌液组菌数]×100%。稀释剂对照组菌的回收率%=(稀释剂对照组菌数/菌液组菌数)×100%。结果见表1。

      1 平皿法验证试验回收率(%

      供试品

       

      菌株

       

      匹伐他汀钙片(1mg/片)

      匹伐他汀钙片(2mg/片)

      供试组(1

      供试组(2

      稀释剂对照组

      供试组(1

      供试组(2

      稀释剂对照组

      大肠埃希菌

      1

      70

      88

      98

      68

      79

      96

      2

      69

      87

      83

      59

      76

      97

      3

      74

      74

      91

      66

      87

      91

      71

      83

      91

      64

      81

      95

      金黄色葡萄

      球菌

      1

      75

      84

      89

      70

      100

      87

      2

      71

      87

      93

      65

      87

      92

      3

      76

      95

      87

      71

      84

      93

      74

      89

      90

      69

      90

      91

      枯草芽孢杆菌

      1

      65

      98

      95

      65

      91

      88

      2

      74

      92

      88

      68

      86

      81

      3

      75

      99

      94

      60

      91

      88

      71

      96

      92

      64

      89

      86

      白色念珠菌

      1

      60

      61

      94

      40

      45

      87

      2

      54

      41

      92

      32

      38

      92

      3

      54

      54

      85

      33

      29

      94

      56

      52

      90

      35

      37

      91

      黑曲

      霉菌

      1

      61

      57

      95

      44

      50

      91

      2

      51

      68

      80

      51

      35

      87

      3

      61

      69

      87

      44

      41

      84

      58

      65

      87

      46

      42

      87

      由表1可知,匹伐他汀钙片(1mg/片与2mg/片)在稀释液(2)稀释下,采用常规法对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的回收率均高于70%,表明其对细菌无抑制作用,可采用常规法进行细菌菌数的测定;而对白色念珠菌和黑曲霉的回收率均低于70%,该方法不成立。

      2.3.2 培养基稀释法:分别取供试液0.5mL/皿和0.2mL/皿,再加入白色念珠菌、黑曲霉菌各50100cfu,同常规法进行试验。结果见表2。

      2 稀释法验证真菌试验回收率(%

      方法

      供试品

      白色念珠菌

      黑曲霉菌

      1

      2

      3

      1

      2

      3

      培养

      基稀

      释法

      (0.5mL/)

      匹伐他汀钙片

      1mg/片)

      供试组(1

      36

      34

      40

      37

      30

      37

      36

      34

      供试组(2

      59

      55

      58

      57

      53

      43

      47

      48

      匹伐他汀钙片

      2mg/片)

      供试组(1

      32

      28

      24

      28

      22

      18

      17

      19

      供试组(2

      48

      50

      51

      50

      37

      44

      48

      43

      培养

      基稀

      释法

      (0.2mL/)

      匹伐他汀钙片

      1mg/片)

      供试组(1

      65

      68

      71

      68

      64

      59

      61

      61

      供试组(2

      87

      98

      90

      92

      82

      75

      88

      82

      匹伐他汀钙片

      2mg/片)

      供试组(1

      71

      68

      73

      71

      58

      62

      63

      61

      供试组(2

      94

      90

      83

      89

      73

      71

      75

      73

       

       SHAPE  \* MERGEFORMAT 1:白色念珠菌菌落形态                 2:黑曲霉菌落形态

      由表2可知:匹伐他汀钙片(1mg/片与2mg/片)经过稀释液(1)和稀释液(2)稀释的,采用稀释法(0.5ml/皿)对白色念珠菌和黑曲霉的回收率仍低于70%;经过稀释液(1)稀释,采用稀释法(0.2ml/皿)对白色念珠菌和黑曲霉的回收率仍低于70%,而经过稀释液(2)稀释,采用稀释法(0.2ml/皿)对白色念珠菌和黑曲霉的回收率高于70%。此方法成立。稀释(1)采用稀释法(0.2ml/皿)可在一定程度上可以消除抑菌作用,但回收率仍不能达到70%,而稀释液(2)中加入了胰酪胨大豆肉汤,回收率高于70%,这与胰酪胨大豆肉汤对微生物的促生长作用密切相关。

      匹伐他汀钙片(1mg/片与2mg/片)经过不同稀释液稀释后,其菌落形态也有较大差异。由图1可以看出:供试组(1)的白色念珠菌落呈红色,菌落数量少;供试组(2)的白色念珠菌落呈粉红色,菌落数量多,呈圆形及不规则形态;菌液组的菌落颜色及形态与供试组(2)相似。由图2可以看出:供试组(1)的黑曲霉菌落颜色较菌液组略深,呈粉红色;供试组(2)的黑曲霉菌落形态与菌液组相似,颜色呈微黄色,菌落较大。

      乳糖是匹伐他汀钙片的主要赋形剂,在该药品中质量较大,其对大多数的细菌、霉菌及酵母菌尤其是乳酸菌具有促生长作用[2]。本研究对乳糖中的细菌、霉菌和酵母菌进行了检测,发现在乳糖中生长大量的菌落,菌落形态及颜色同菌液组相似。建议原辅料进厂前应要进行严格的微生物检验。

      2.3.3 控制菌方法验证(常规法):取1:10的供试液(1)和供试液(2)的上清液各10mL,分别加入大肠埃希菌10100cfu,加入到100mL的胆盐乳糖增菌培养基中,3035℃培养,结果见表3。标准规定试验组应检出试验菌。

      3 控制菌检查方法验证结果

      试验组

      100mLBL

      MUG培养基

      靛基质试剂

      匹伐他汀钙片

      1mg/片)

      供试组(1

      溶液浑浊

      阳性

      阳性

      供试组(2

      溶液浑浊

      阳性

      阳性

      匹伐他汀钙片

      2mg/片)

      供试组(1

      溶液浑浊

      阳性

      阳性

       

      供试组(2

      溶液浑浊

      阳性

      阳性

      试验结果表明:匹伐他汀钙片(1mg/片与2mg/片)的供试组(1)和(2)都分别检出了大肠埃希菌,可采用常规法进行控制菌的大肠埃希菌检查。

      3 结论

      为了消除匹伐他汀钙片的抑菌性,按照中国药典2010年版二部对其进行微生物限度方法验证,细菌可采用平皿法;霉菌和酵母菌可经过稀释液(2)稀释后,采用稀释法(0.2ml/皿);控制菌大肠埃希菌可采用常规法。

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