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    4. 学术交流

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      顶空采样-毛细管气相色谱法分析 绞股蓝提取物中的溶剂残留
      发布时间:2014/8/11  浏览次数:6173 次  来源:陕西省食品药品监督检验研究院

      顶空采样-毛细管气相色谱法分析

      绞股蓝提取物中的溶剂残留

      李涛1,盛喜霞2,刘继平3

      1. 陕西省食品药品检验所,西安 710061;2. 西安兵器工业卫生研究所,西安 710065;

      3.陕西中医学院药理教研室,咸阳 712046

        :目的:建立了顶空采样-毛细管气相色谱检测绞股蓝提取物中溶剂残留的分析方法。对产自国内12个生产厂家的32批绞股蓝提取物样品中有机溶剂的残留状况进行了系统评价,结合生产工艺信息,确定了甲醇、正丁醇、异丁醇、正己烷、苯、甲苯、邻二甲苯、对二甲苯、1,2-二乙基苯、苯乙烯、二乙烯苯和三氯甲烷等12种有机溶剂为残留检测对象。方法:采用顶空采样-毛细管气相色谱法,用HP-WAX极性毛细管色谱柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm),程序升温:初始温度40 ℃5 min),10 ℃.min-1至150 ℃1 min),再以20 ℃.min-1至200 ℃2 min),FID检测器检测。结果:12种残留组分在各自的浓度范围内呈良好的线性关系(r=0.99950.9999,n=6),最低检出限范围为0.420 mg/kg,并在2批样品中分别检出了甲醇、正丁醇等几种试剂。12种残留组分检测的平均添加回收率为85.6%99.5%RSD1.1%4.6%,n=6)。结论:该法简单、灵敏、可靠,适用于绞股蓝提取物中残留溶剂的分析确证。

      关键词:气相色谱法;顶空采样;绞股蓝提取物;残留溶剂

      绞股蓝提取物(Gynostemma Extract)是以绞股蓝为原料经提取而成并作为保健食品原料的提取物。本品从葫芦科植物绞股蓝Gynostemma pentaphyllumThunb.Makino全草中提取得到。目前,由于国内从事绞股蓝植物提取的企业大多规模小,设备落后,缺乏市场研发和技术研发力量,造成产品质量缺乏竞争力,加之缺乏有效的质控标准,一些劣质产品甚至掺伪产品进入市场,影响了整个行业发展,并威胁到以此为原料的保健食品质量。

      绞股蓝提取物因主要成分为绞股蓝皂苷,各生产厂方工艺不同,有的采用大孔树脂净化、有的用正丁醇萃取,有的企业为了降低成本使用二类溶剂甲醇提取,甚至还有一些未知的特殊提取方法。各种提取方法都可能带来一些有害的溶剂残留,所以必须对其残留量加以控制。

      本文采集了国内12家企事业单位生产的32批绞股蓝提取物样品,根据《中国药典》2010年版推荐的筛选考察方法和残留溶剂相对保留时间参考值,对绞股蓝提取物样品中可能含有的残留溶剂种类进行了全面和系统的评价实验,并结合不同企业的生产工艺信息以及国家食品药品监督管理局2005年发布的应用大孔吸附树脂分离纯化工艺生产的保健食品申报与审评规定(试行)(国食药监注[2005]202号)的规定,采用毛细管气相色谱法、毛细管气相色谱-质谱联用法,配以顶空进样,研究可能存在的大孔树脂残留溶剂和甲醇、正丁醇、异丁醇、三氯甲烷等溶剂残留,共确定了12种有机溶剂作为检测对象,建立了顶空采样-毛细管气相色谱检测绞股蓝提取物溶剂残留的方法,并对所建立的方法进行了验证。该法操作简便,重现性好,可满足本品的质量控制。

      1 仪器与试剂

      Agilent7890A气相色谱仪,氢火焰离子化检测器(FID),G1888顶空进样器;甲醇、正丁醇、异丁醇、正己烷、苯、甲苯、邻二甲苯、对二甲苯、1,2-二乙基苯、苯乙烯、二乙烯苯、三氯甲烷以及N,N-二甲基甲酰胺均为色谱纯试剂。绞股蓝提取物分别为由国内12家企事业单位生产提供的32批样品【A20100926、20100826、20100825、20100930、20101001、20101002、20101003);B20100925、20100926);C20100110、20100228、20100323、20100409);D20100203、20100320、20100425、20100513);E100308);F20090609、20100102、20100103);G20091008、20091101、20091102);H100118、100325、100426、100511);I20100312);J20070601);K20100312);L100412)】

      2 溶剂残留状况(残留溶剂种类分布)评价实验

      为尽可能减小样品热降解的可能性,并确保残留组分能够获得足够的蒸气压,同时考虑DMF较好的溶解性,本文在评价实验中采用90 ℃加热30 min的顶空条件,并启用G1888顶空进样器的振摇功能,加速达到动态平衡。

      色谱条件:毛细管色谱柱为HP-1非极性色谱柱和HP-FFAP 极性色谱柱;进样口温度为200 ℃;氢火焰离子化检测器(FID)温度为250 ℃;起始柱流量为1.5 mL/m in。

      N,N-二甲基甲酰胺为溶剂,制成对照品溶液,分别按照《中国药典》中两种色谱柱各自的程序升温色谱条件,测定样品溶液中各挥发性组分相对于参比溶剂丁酮的相对保留时间(TRR);配制样品溶液,分别按照《中国药典》中所用的两种色谱柱各自的等温色谱条件测定各挥发性组分相对于丁酮的TRR。

      根据相对保留时间的测定值与《中国药典》相对保留时间参考值的接近程度,以及是否在两种色谱柱或两种温度系统中均出现等条件进行层层筛选,最终确定样品中是否存在某种溶剂残留。

      在溶剂残留状况评价实验中,本文以如下原则对色谱数据进行处理:

      1)将样品溶液色谱图与空白溶剂色谱图进行比较,具有与空白色谱峰相同TRR而峰面积没有明显增加的色谱峰被剔除,否则被保留;

      2TRR与最接近参考值的相对误差超过5%的色谱峰被剔除,否则被保留;

      3)在两种色谱柱系统中均存在的色谱峰被保留,否则被剔除;在程序升温和等温系统中均存在的色谱峰被保留,否则被剔除。

      3 残留溶剂的检测方法

      3.1 色谱和顶空条件

      试验中考察了DB-624、DB-5、DB-WAX三款毛细管色谱柱,并对程序升温条件进行优化;考虑到以上溶剂的沸点不一,如甲苯、正丁醇、异丁醇沸点均超过100℃,故对顶空瓶平衡温度进行优化,为使残留组分在样品基质中达到与系列标准溶液一致的蒸气压,并兼顾高温加热条件下样品热降解的可能性,最终确定如下色谱和顶空条件。

      色谱柱:以键合/交联聚乙二醇为固定相的毛细管柱(柱长为30 m,内径为0.32 mm,膜厚度为0.50 μm);柱温为程序升温,起始温度为40 ℃,保持5 min,以每分钟10 ℃升温至150 ℃,保持1 min,再以每分钟20 ℃升温至200 ℃,保持2 min;用氢火焰离子化检测器检测,检测器温度250 ℃;进样口温度200 ℃;载气为氮气,流速为1.5 mL/min;顶空进样,顶空瓶平衡温度为90 ℃,平衡时间为30 min。理论板数以邻二甲苯峰计算应不低于50000。

      1 对照品分离示意图

      2 绞股蓝提取物分离示意图(正丁醇萃取法)

      3 绞股蓝提取物分离示意图(大孔树脂法)

      3.2  对照品溶液的制备

      精密称取甲醇、正丁醇、异丁醇、氯仿、正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、1,2-二乙基苯和二乙烯苯对照品适量,加50% N,N-二甲基甲酰胺溶液制成每1 mL中分别含甲醇、正丁醇、异丁醇、氯仿、正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、1,2-二乙基苯和二乙烯苯500 μg、500 μg、500 μg、5 μg、5 μg、1 μg、5 μg、5 μg、5 μg、5 μg、5 μg1 μg的溶液,作为对照品贮备液。

      3.3 样品处理方法的选择确认

      本品主要为皂苷类成分,在水中溶解性较好,故选择以水作溶剂,但由于本品主含皂苷类成分,皂苷类成分在振摇中会产生大量持久性泡沫,故取样量不宜过大,且不宜振摇,测试中选择了取样0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g、0.5 g、1.0 g,加水密封后,采用超声处理以利于充分溶解?悸堑礁貌诽匦,最终确立方法如下:

      取本品约0.1 g,精密称定,置20 mL顶空瓶中,精密加入纯化水5 mL,密封,超声处理10 min,置入顶空进样器中,测定,即得。

      3.4 线性关系考察

      精密吸取上述对照品贮备液适量,置50 mL量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,制成系列浓度对照品溶液。精密量取5 mL,置20 mL顶空瓶中,密封,即得。

      以浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,求得回归方程。二乙烯苯以其同分异构体的峰面积之和计。结果见表2

      4 检测限试验

      精密吸取上述对照品贮备液适量,加水稀释逐级稀释,当信噪比(S/N=3)时得到12种溶剂的最低检测限,见表2。

      5 重复性试验

      精密吸取上述贮备液1 mL,置50 mL量瓶中,加5% N,N-二甲基甲酰胺溶液稀释至刻度,摇匀(甲醇、正丁醇、异丁醇、氯仿、正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、1,2-二乙基苯和二乙烯苯),精密量取5 mL,置20 mL顶空瓶中(共6份),密封,测定,计算各对照品峰面积积分值的RSD%,见表2。

      6 回收率试验

      精密称取已知溶剂残留量的绞股蓝提取物(批号:201010010.1 g(共6份),精密加入重复性试验项下配制的对照品溶液5 mL,密封,测定,计算回收率,见表1。

      1 回收率试验结果

      组分

      平均回收率(%

      RSD%

      甲醇

      90.2

      1.6

      正丁醇

      93.1

      3.5

      异丁醇

      94.2

      2.2

      氯仿

      91.8

      3.8

      正己烷

      88.5

      3.6

      95.3

      2.7

      甲苯

      99.5

      2.5

      对二甲苯

      95.4

      1.2

      邻二甲苯

      94.6

      1.1

      苯乙烯

      92.7

      3.9

      1,2-二乙基苯

      94.6

      1.6

      二乙烯苯

      85.6

      4.6

      7 方法检测限

      方法检测限见表2!咎乇鹚得鳎汗沂称芬┢芳喽焦芾砭2005年发布的应用大孔吸附树脂分离纯化工艺生产的保健食品申报与审评规定(试行)(国食药监注[2005]202号)第四条规定对用苯乙烯骨架型树脂制备的原料中二乙烯苯含量要求为小于50 μg/kg。但是由于该品种的特殊性,在本品种中二乙烯苯残留的方法检测限只能达到0.4 mg/kg,虽然不能确认生产中是否使用了苯乙烯骨架型树脂!

      2 线性关系和检测限结果表

      组分

      线性范围

      μg.mL-1

      回归方程

      r

      检测限

      ng.mL-1

      方法检测限

      mg/kg

      重复性

      RSD/%

      甲醇

      5001

      Y=0.1025X-0.0756

      0.9999

      400

      20

      1.3

      正丁醇

      1000.2

      Y=0.5022X-0.1650

      0.9999

      200

      10

      2.5

      异丁醇

      1000.2

      Y=0.6967X-0.2399

      0.9999

      200

      10

      1.2

      氯仿

      1000.2

      Y=0.7257X-0.9183

      0.9996

      200

      10

      4.1

      正己烷

      100.04

      Y=3.7932X-0.7099

      0.9995

      20

      1.0

      4.9

      100.02

      Y=9.3018X-1.1243

      0.9997

      8

      0.4

      1.6

      甲苯

      100.02

      Y=9.8338X-0.9047

      0.9997

      8

      0.4

      3.2

      对二甲苯

      100.02

      Y=10.2470X-0.8785

      0.9997

      8

      0.4

      2.9

      邻二甲苯

      100.02

      Y=10.2370X-0.8247

      0.9997

      8

      0.4

      2.1

      苯乙烯

      100.02

      Y=9.5698X-0.6132

      0.9998

      8

      0.4

      3.6

      1,2-二乙基苯

      100.02

      Y=11.0530X-0.7222

      0.9998

      8

      0.4

      2.8

      二乙烯苯

      100.02

      Y=9.4015X-0.3644

      0.9999

      8

      0.4

      4.3

      8 限度制定及样品测定

      参照《中国药典2010年版》附录残留溶剂测定法、人用药品注册技术要求国际协调会( ICH )以及国家食品药品监督管理局2005年发布的应用大孔吸附树脂分离纯化工艺生产的保健食品申报与审评规定(试行)(国食药监注[2005]202号)的有关规定及要求,并结合保健食品的长期食用特点,暂定限度如下:

      3 绞股蓝提取物中溶剂残留限度表

      溶剂

      名称

      溶剂

      类别

      本标准限度

      mg/kg

      ICH规定

      mg/kg

      《中国药典2010年版一部》有关提取物大孔树脂残留的限度(mg/kg

      甲醇/(mg/kg)

      二类

      ≤500

      3000

      /

      正丁醇/(mg/kg)

      三类

      ≤500

      5000

      /

      异丁醇/(mg/kg)

      三类

      ≤500

      5000

      /

      氯仿/(mg/kg)

      二类

      ≤5

      60

      /

      正己烷/(mg/kg)

      二类

      ≤5

      290

      20

      甲苯/(mg/kg)

      二类

      ≤5

      890

      20

      对二甲苯/(mg/kg)

      /

      ≤5

      未单独

      规定

      20

      邻二甲苯/(mg/kg)

      /

      ≤5

      20

      苯乙烯/(mg/kg)

      /

      ≤5

      /

      20

      1,2-二乙基苯/(mg/kg)

      /

      ≤5

      /

      20

      二乙烯苯/(mg/kg)

      /

      ≤1

      /

      20

      /(mg/kg)

      一类

      ≤1

      2

      2

      4 样品溶剂残留测定结果表

      编号

      检出主要溶剂种类

      超标溶剂

      1

      正丁醇、异丁醇

      /

      2

      甲醇、乙醇

      /

      3

      甲醇、乙醇

      /

      4

      甲醇、乙醇

      /

      5

      甲醇、乙醇

      /

      6

      甲醇、乙醇

      /

      7

      甲醇、乙醇

      /

      8

      甲醇、乙醇

      /

      9

      甲醇、乙醇

      /

      10

      正己烷、乙醇、氯仿、正丁醇

      氯仿

      11

      正己烷、乙醇、氯仿、正丁醇

      氯仿

      12

      正己烷、乙醇、氯仿、正丁醇

      氯仿

      13

      正己烷、乙醇、氯仿、正丁醇

      氯仿

      14

      正己烷、乙醇、氯仿、异丁醇、正丁醇、1,2-二乙基苯、二乙烯苯

      氯仿

      15

      正己烷、乙醇、氯仿、异丁醇、正丁醇、对二甲苯

      正丁醇

      16

      正己烷、乙醇、氯仿、异丁醇、正丁醇、对二甲苯

      氯仿

      17

      正己烷、乙醇、氯仿、异丁醇、正丁醇、苯乙烯

      异丁醇、正丁醇

      18

      甲醇、乙醇

      /

      19

      乙醇、氯仿、正丁醇

      氯仿、正丁醇

      20

      乙醇、氯仿、正丁醇

      氯仿、正丁醇

      21

      乙醇、氯仿、正丁醇

      氯仿、正丁醇

      22

      正己烷、乙醇、氯仿、异丁醇、正丁醇、邻二甲苯

      氯仿、正丁醇

      23

      正己烷、乙醇、氯仿、异丁醇、正丁醇、邻二甲苯

      氯仿、正丁醇

      24

      正己烷、乙醇、氯仿、异丁醇、正丁醇、邻二甲苯

      氯仿、正丁醇

      25

      乙醇、正丁醇

      正丁醇

      26

      乙醇、正丁醇

      正丁醇

      27

      乙醇、正丁醇

      正丁醇

      28

      乙醇、正丁醇

      正丁醇

      29

      正己烷、乙醇、氯仿、异丁醇、正丁醇

      氯仿、正丁醇

      30

      乙醇、氯仿、异丁醇、正丁醇

      氯仿、正丁醇

      31

      乙醇、氯仿、异丁醇、正丁醇

      氯仿、正丁醇

      32

      乙醇、氯仿、异丁醇、正丁醇

      氯仿、正丁醇

      9 讨论

      9.1  结果显示:32批样品中溶剂检出种类差别较大,主要原因是采用工艺制法不一致。

      9.2  采用正丁醇萃取工艺的样品均检出正丁醇,且大部分超标,这是由于正丁醇沸点高(达117 ℃)以及干燥工艺不完善所致,该工艺制法成本较低,但由于正丁醇对人体具有刺激和麻醉作用,加之高沸点难挥发对环境会造成一定积蓄污染,因此建议该工艺限制使用。

      9.3  部分样品中检出甲醇,甲醇为二类溶剂,主要为乙醇中的甲醇残留或为降低成本直接使用含大量甲醇的工业酒精提取甚至直接使用甲醇提取。

      9.4  乙醇由于是工艺中正常引入,为三类溶剂,毒性较小,环境污染小,并且在32批样品中未见较高残留,故未将其纳入检测标准。检出二类溶剂氯仿,原因暂时不明,有待研究。

       

       

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